[ЗАСТАВКА] В настоящее время существует достаточно большое количество платформ для проведения как таргетного, так и полногеномного секвенирования, и основные платформы, наиболее значимые, мы рассмотрим в сегодняшней лекции. Это платформа Roche 454, предлагающая секвенирование с помощью так называемого метода пиросеквенирования, которые были разработаны в 2005 году. Технология SOLiD, позволяющая секвенировать ДНК путем лигирования, разработанная... внедренная в 2006 году в практику. Компания Illumina предлагает секвенаторы, позволяющие определять нуклеотидную последовательность ДНК путем синтеза, и данная технология была внедрена в 2006 году. Технология Ion Torrent представляет собой технологию полупроводникового секвенирования. Она была внедрена в 2010 году. Компания Pacific Biosciences предложила технологию секвенирования единичной молекулы ДНК в реальном времени, и она, технология эта была внедрена в 2011 году. А компания Oxford Nanopore предложила технологию секвенирования с использованием нанопор — это самая новая технология, которая была внедрена в 2014 году. Итак, давайте рассмотрим эти технологии немного подробнее. Начнем с технологии Roche 454. Компания Roche на данный момент перестала продавать эти секвенаторы, однако они все еще применяются. И поэтому давайте разберемся, в чем же заключается основной принцип предлагаемого метода пиросеквенирования. А в... для реализации этого метода компания выпустила две платформы — это FLX (система FLX) и система Junior. Они отличаются количеством производимых данных и немного отличаются длиной прочтения. Система FLX — это более мощная система. Она позволяет получать больше данных, то есть около 700 Mb. А система Junior — это такая более простая легкая система так называемого настольного секвенатора, которая позволяет получать порядка 35 Mb. Значит, в основе секвенирования с использованием платформы 454 заключаются технологии пиросеквенирования. Для того чтобы начать сиквенс, ДНК необходимо фрагментировать. Далее к молекулам ДНК пришиваются адаптеры с обоих концов, после чего нити ДНК денатурируют и прикрепляют к бусинам для амплификации. Амплификацию проводят вот на поверхности бусин в капле масла, и процедура эта называется эмульсионная ПЦР. Реакцию амплификации проводят таким образом, чтобы к каждой из бусин присоединилась всего лишь одна молекула ДНК, и в результате ПЦР сформировалось достаточно большое количество ее клонов. И мы видим на слайде, как в результате ПЦР на некоторых бусинах сформировалось достаточно большое количество клонов ДНК, а на некоторых ничего не сформировалось, потому что нити не присоединились, и ПЦР, соответственно, не прошла. После проведения эмульсионной ПЦР бусины помещают на определенную плашку. Каждый из них располагается в своей лунке, и начинается процесс секвенирования, который заключается в следующем: процесс секвенирования начинается с присоединения праймера и удлинения нити ДНК. Во время удлинения синтеза нити ДНК происходит присоединение того или иного нуклеотида, и в случае, если он присоединяется, в результате реакции высвобождается свободный пирофосфат. В результате того, что в реакционной смеси присутствуют ферменты сульфурилазы и люциферазы, происходит высвобождение кванта света, который детектируется камерой секвенатора. Присоединении нуклеотида преобразуется световой сигнал, и по интенсивности свечения определят, какое же количество нуклеотидов присоединилось. Если к молекуле ДНК присоединяется один тип нуклеотида, то высота пика, которая равнозначна интенсивности свечения, является относительно небольшой. В случае, если присоединилось две... два нуклеотида, то интенсивность становится выше, если три, то интенсивность... четыре, то интенсивность будет еще выше. Таким образом, по интенсивности свечения, зная, какие нуклеотиды на данный момент подавались в реакцию и какие из них включились, а какие нет, можно определить первичную последовательность молекулы ДНК. Технология, предлагаемая компанией Ion Torrent (полупроводниковое секвенирование), чем-то похожа на технологию 454. Компания Ion Torrent точно так же предложила два секвенатора, один из которых настольный PGM, а второй Ion Proton — более мощный, позволяющий получать большее количество данных. Библиотеки готовятся точно так же, как и для технологии 454: это ДНК фрагментируют сначала, далее прикрепляют адаптеры, проводят эмульсионную ПЦР на поверхности бусин, а далее проводят секвенирование. Секвенирование основано на следующем принципе: во время синтеза ДНК с помощью полимеразы в реакционную смесь последовательно подаются нуклеотиды, каждый раз разные, и в случае, если они встраиваются в растущую цепь, высвобождается ион водорода, что приводит к изменению кислотности среды. Очень точный pH метр измеряет, и таким образом детектирует, включился тот или иной нуклеотид или не включился, и восстанавливает первичную последовательность ДНК. Если нуклеотид не включается в растущую цепочку, то pH среды не меняется, и таким образом ничего не детектируется. Если же в последовательность ДНК включаются одновременно несколько идентичных нуклеотидов, то, соответственно, и pH меняется несколько сильнее и пик, который мы можем заметить, намного выше, чем пики при включении единичного нуклеотида. Еще одна платформа, которую мы рассмотрим — это платформа SOliD, представленная компанией Life Technologies в 2006 году. Она интересна принципом работы секвенатора, а именно для секвенирования ДНК используется лигирование олигонуклеотидов. Технология является очень точной, однако длина прочтения, которую она обеспечивает, очень короткая. Для того чтобы провести секвенирование, необходимо фрагментировать ДНК, провести лигирование адаптеров и эмульсионную ПЦР, а далее проходит сама реакция лигирования. Вот на данном слайде мы видим основные этапы подготовки. ДНК фрагментируется, адаптеры лигируются, после чего происходит эмульсионная ПЦР на поверхности определенных бусин. Бусины после проведения ПЦР распределяются на поверхности плашки. Реакция секвенирования начинается с того, что к одноцепочечной молекуле ДНК присоединяется праймер, а далее последовательно происходит лигирование олигонуклеотидов, которые имеют специфично связывающийся динуклеотид на 3'-конце и несколько нуклеотидов на 5'-конце, которые способны связываться с ДНК неспецифично. Кроме того, на 5'-конце каждый олигонуклеотид несет один из четырех хлорофоров. Если происходит реакция лигирования, то есть происходит специфическое связывание двух нуклеотидов на 3'-конце, и лигаза сшивает праймер и олигонуклеотид в единую цепь, происходит отщепление хлорофора спец-штрих-конца и детекция флуоресцентного сигнала. Далее происходит аналогичное присоединение олигонуклеотидов и определение нуклеотидной последовательности нити ДНК. Однако, как мы можем видеть, специфическое связывание происходит только двух нуклеотидов на 3'-конце. Три другие нуклеотида, которые остаются после отщепления хлорофора, связываются неспецифично, и последовательность ДНК, с которой они связались, мы не можем определить. Что же нужно сделать, для того чтобы прочитать последовательность ДНК, с которой связались неспецифичные нуклеотиды? Необходимо использовать праймер на один нуклеотид короче. То есть после проведения первого раунда сиквенса происходит отсоединение синтезированного... синтезированной нити ДНК, присоединяется новый праймер, который короче первого на один нуклеотид, и далее происходит аналогичным образом гибридизация и лигирование соответствующих нуклеотидов. Также происходит и третий раунд секвенирования, но для него используется праймер, который короче первого на два нуклеотида, потом проводится еще один четвертый раунд секвенирования с использование праймера, который короче на 3 нуклеотида, чем первый. И происходит заключительный пятый раунд секвенирования, для которого применяется праймер еще более короткий, и он на 4 нуклеотида короче праймера, использованного на первом раунде. Таким образом мы видим, что секвенирование каждого нуклеотида в молекуле ДНК происходит дважды. И это обеспечивает высокую точность этой технологии, однако длина прочтения является очень небольшой. Стоит отметить, что рассмотренные нами технологии обеспечивают прочтение библиотеки с одной стороны. Только с одной стороны прочитывается фрагмент ДНК. Технологию, которая применяется для секвенирования с помощью платформ, представляемых компанией Illumina, обеспечивает секвенирование библиотеки ДНК с обеих сторон, и если нашла библиотека достаточно короткая, то нуклеотиды прочитываются 2 раза. На данном слайде мы видим платформы для секвенирования геномов, предлагаемые компанией Illumina: настольный секвенатор MiSeq, позволяющий получать до 15 миллиардов пар нуклеотидов за один запуск; это секвенатор NextSeq, который позволяет прочитать около 120 миллиардов нуклеотидов за один запуск; и секвенатор HiSeq, имеющий самый большой... самую большую производительность, более 1000 gigabase за один запуск и более 4 тысяч миллионов прочтений. ДНК-библиотека, которая готовится для секвенирования на платформах Illumina, выглядит следующим образом: это фрагменты ДНК, которые мы анализируем, к которым лигируются адаптеры, а также индексы с двух сторон разные, либо одинаковые, и еще один адаптер для амплификации геном-библиотеки. Технология секвенирования, предлагаемая компанией Illumina, несколько отличается от рассмотренных нами ранее. После подготовки лигирования адаптеров, индексов и праймеров к ДНК, библиотека гибридизуется на поверхности проточной ячейки, связывается с олигонуклеотидами, которые там заранее расположены, и в результате Bridge PCR происходит генерация кластеров. А после этого происходит секвенирование путем синтеза, и в результате секвенирования подаются последовательно нуклеотиды, которые, если присоединяются к растущей нуклеотидной цепочке, то можно детектировать световой сигнал. Если они не присоединяются, то, соответственно, сигнала никакого нету, и камера ничего не детектирует. Вот на слайде более подробное описание самой процедуры, сначала готовятся библиотеки к молекулам ДНК, пришиваются адаптеры, далее библиотеки... молекулы ДНК денатурируются, и одноцепочечные нити ДНК связываются с поверхностью проточной ячейки. После чего происходит этап амплификации с помощью так называемого Bridge PCR, мостиковый ПЦР, это приводит к формированию большого числа кластеров, и формирование большого числа кластеров, то есть увеличение количества копий конкретных нитей ДНК усиливают сигнал на этапе секвенирования, и в случае, если присоединяется олигонуклеотид, происходит параллельно сиквенс одновременно большого количества библиотек, и в случае, если присоединяется какой-то нуклеотид, то сигнал достаточно сильный, и лазер возбуждает сигнал, позволяет камере детектировать его. В случае, если нуклеотид не присоединяется, то, соответственно, никакого... детекции сигнала не происходит. Это позволяет программному обеспечению в дальнейшем формировать файлы с нуклеотидными последовательностями и что дальше позволяет нам уже работать с ними. [ЗВУКОВАЯ_ЗАСТАВКА]
